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摘要 目的: 研究運動訓練對腦梗死大鼠行為學的影響并從神經可塑性角度探討其機制。

方法: 用線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）腦梗死模型, 56 只 Wistar 大鼠隨機分為假手術組、 模型組和康復組。康復組于手術后 5 天開始進行滾筒、 轉棒、 平衡木、 網屏訓練, 每日 40min, 每周 6 次, 共 5 周, 假手術組與模型組則維持原來生活狀態。對大鼠進行神經功能、運動能力和學習記憶能力測評觀察其行為學變化, 免疫組化法觀察缺血區神經絲蛋白 200（NF200）的表達變化。

結果: 康復組大鼠神經功能、 運動能力、 學習記憶能力優于模型組, 神經功能在 3 周差異有顯著性意義（ P<0.05） , 其轉棒實驗和平衡木實驗在 3 周、 5 周（ P<0.01—0.05）差異有顯著性意義, 網屏實驗在 3 周、 5 周差異有顯著性意義（ P<0.05） , 學習記憶能力在 5 周有極顯著性意義（ P<0.01）。康復組大鼠缺血區 NF200 蛋白質陽性表達較模型組增多, 在 3 周時差異有顯著性意義（ P<0.05） , 5 周時有極顯著性意義（ P<0.01）。

結論: 運動訓練促進腦梗死大鼠神經功能、 運動能力、 學習記憶能力的恢復, 其機制可能與缺血區 NF200 蛋白質表達上調有關。關鍵詞 腦梗死; 大鼠; 運動訓練; 行為學; 神經絲蛋白 200腦梗死是神經系統的常見病和多發病, 患者常有相應的運動、 感知覺、 學習記憶等行為能力障礙,給社會和家庭帶來沉重負擔, 這就需要采用*技術提高患者的生存質量和改善其功能障礙。運動是中樞神經系統zui有效的刺激形式, 所有的運動都可向中樞神經提供感覺、 運動和反射性傳入。 運動對大腦的功能重組和代償起著重要作用。Stroemer等[1]證實神經元軸突的發芽和突觸形成與動物的行為學恢復密切相關。神經絲蛋白（ neurofilament, NF）是神經元的結構蛋白, 是神經元所*的細胞骨架,對維持神經元的形態、結構及生理功能都具有重要意義, 它代表著神經元的功能和。 根據其分子量的大小不同分為 NF60、 NF160 和 NF200 三種亞單位, NF200 是 3 種 NF 蛋白的重要成分, 主要存在于神經元軸突的遠側部分。因此,可以用磷酸化 NF200蛋白質作為神經元軸突的標記物, 了解運動訓練對神經元軸突的可塑性影響, 初步探討運動改善腦梗死大鼠行為學影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性 Wistar 大鼠 56 只, 體重 280± 50g, 周齡 8 周, 由瀘州醫學院實驗動物科提供。 分為假手術組、 模型組（腦梗死自由活動組）、 康復組（腦梗死運動訓練組） , 其中模型組和康復組各分手術后 1 周、 3周、 5 周 3 個時點, 每組各 8 只大鼠。

1.2 局灶性腦缺血模型

按照小泉線栓法制成右側大腦中動脈缺血梗死模型[2]。用 1%的戊*鈉按照 30—40mg/kg對大鼠進行腹腔麻醉, 固定于*上, 頸部右旁中切開, 分離右頸總動脈、 頸內動脈、 頸外動脈。 在翼腭動脈起始部置一*, 結扎切斷頸外動脈, 在頸外動脈的起始部剪一直徑 0.2mm的小口, 將預先用紫藥水煮過且染成紫色的強力尼龍釣魚線 （ 直徑0.22mm, 長 20mm） , 離頭端 4mm處均勻地涂上一層聚氨酯輕漆, 使其頭端形成一光滑的錐形, 頭端直徑約 0.25mm。線栓從頸外動脈殘端插入, 經頸動脈分叉后沿頸內動脈入顱, 至大腦前動脈, 稍感阻力時停止, 插入深度從分叉部計約 17—19mm, 然后用手術線結扎頸總動脈分叉處, zui后縫合皮膚, 手術完畢后放回鼠籠正常喂食和飲水, 術后注意對動物進行保溫。 假手術組只是在動脈內不插線, 其余步驟與模型組和康復組*一致。模型成功標志是動物蘇醒后表現為提尾時左側前肢內收屈曲; 同側 Hornor 征;爬行時向左劃圈; 站立時左側傾倒。 凡具有上述四項體征者列入研究對象。

1.3 運動訓練

康復組于術后休息 4d, 從第 5d 起開始采用自制儀器進行運動訓練:①滾筒網狀式訓練儀: 為一長100cm, 直徑 60cm 的圓形網狀儀器, 底座有一固定架, 一端有一手搖柄, 將大鼠放于其中讓其被動跑籠, 訓練大鼠抓握、 旋轉及行走能力。 ②平衡訓練: 將大鼠放于距地面 5cm 高, 長 150cm、 寬 2cm 的方木棒上, 用食物誘導其行走, 訓練平衡能力。③網屏訓練: 將大鼠放于網眼 1cm× 1cm, 網寬 50cm× 40cm 的網屏上, 網屏距地面高度 80cm, 下鋪 12cm 厚的海綿。網屏由水平逐步垂直并保持 5s, 觀察大鼠是否從網屏上掉下來或用前爪抓住網屏。大鼠在網屏上的時間越長反映肌力越好, 訓練大鼠的抓握能力及肌力。④轉棒訓練: 為一長 150cm, 直徑 4.5cm的空心鋁棒一根, 其中點固定在 3r/min 的轉動器上, 分別向左右交替轉動, 以訓練其動態平衡。 以上訓練每天共計 40min, 每周 6d。

1.4 神經功能、 運動功能及學習記憶能力的評定假手術組于術后 2h 進行神經功能評分, 術后 1周進行運動能力評分。模型組和康復組于手術后各時點進行神經功能評定和運動能力評分, 在手術后5 周采用 Y-迷宮進行學習記憶行為學測試。神經功能評分根據 Bederson 等[3]制訂的評定方法進行。平衡木測評, 轉棒測評及網屏實驗測評按照各自的評分標準進行[4]。Y-型迷宮測試[5]: Y-型迷宮為一三等臂式迷宮,每臂頂端設有一信號燈, 以此提示 “危險區” 。 信號燈亮 6s, 此臂即為危險區, 通以 36V交流電, 刺激大鼠在通電后從所在的亮臂跑到暗臂。訓練中始終有一臂為安全區, 安全區以無規則的次序變換。 實驗在安靜、 光線較暗的環境中進行。實驗前, 將大鼠放入迷宮, 使其適應 5min, 然后開始實驗。大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為錯誤, 跑到暗臂記為正確。每天訓練 30min, 連續刺激 10 次后大鼠休息2min, 記錄大鼠學會（連續 10 次訓練中有 9 次正確即認為 “學會”）需的訓練次數, 訓練次數越少的表明大鼠學習能力越強, 以此作為判斷大鼠學習分辨能力的指標。

1.5 取材及免疫組化

假手術組 8 只動物在手術后 1 周評定完后取材, 模型組和康復組在手術后各時點評分進行完后分別取材。以 1%的戊*鈉腹腔注射麻醉后, 固定于操作臺上, 迅速開胸, 經左心室插管至主動脈快速灌注肝素生理鹽水 100ml, 再以 4%多聚甲醛行心臟灌注（持續 15min） , 取腦組織置于 4%多聚*中固定過夜, 移入梯度酒精固定, 取右側大腦組織行常規石蠟包埋。用石蠟切片機行連續冠狀切片 （ 片厚 4—6μ m）。烘干。切片經常規脫蠟至水。3%雙氧水, 室溫 5—10min 滅活內源性酶, 蒸餾水沖洗 3 次; 熱修復抗原: 滴加復合消化液 1 滴在切片上, 將切片放入染缸, 置于 PBS液中, 微波爐加熱沸騰, 冷卻后重復1 次, 冷卻后 PBS液沖洗 3 次; 抗原修復液 1 滴滴加在切片上, 室溫 8min, PBS液洗滌 3 次; 滴加適量一抗小鼠 BM0100（ 1∶ 200） , 37℃水浴箱孵育 1h; PBS洗滌, 2min× 3 次; 滴加二抗小鼠 SA1021（ 1∶ 200） , 37℃水浴箱孵育 20min; PBS洗滌, 2min× 3 次; 滴加試劑SABC, 37℃水浴箱孵育 20min; PBS 洗滌, 5min× 4次; DAB顯色: 取蒸餾水 1ml, 滴加試劑盒中A、B、C液各1滴, 混勻后滴加到切片; 室溫顯色, 顯微鏡下控制顯色時間, 約 12—15min, 蒸餾水終止顯色; 每組隨機選 1 張進行蘇木素復染, 脫水、 透明、 封片, 顯微鏡觀察, 數碼相機照相。采用 IS- 44OO圖像分析系統對各組免疫組化實驗結果進行定位、 定性、 定量統計: 用 MLAS- 1000 圖像分析儀, 在 400 倍下進行圖像分析, 每組 5 張切片, 每張切片 5 個視野, 由計算機處理系統測定各組 NF200 陽性纖維的光密度（optical density, OD） , 所有OD值測量都是在相同的光學、光源條件下完成。

1.6 統計學分析

應用 SPSS11.5 對數據進行統計學分析。 P<0.05為差異有顯著性意義。對大鼠神經功能、 運動能力、學習記憶能力測評結果采用 t 檢驗進行兩兩比較。對免疫組化陽性纖維圖像分析儀結果進行單因素方差分析和 t 檢驗, 并用 SNK- q 檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 行為學測試結果

假手術組共8只大鼠, 在手術前1天進行神經功能和運動能力測評,其神經功能、轉棒行走訓練、平衡木步行訓練、網屏訓練評分均為0分, 其手術后2h 神經功能評分也為0分,即假手術組術后無神經缺失癥狀。假手術組于手術后1周進行運動能力評分, 其轉棒行走、平衡木行走、 網屏訓練三項評分均為0分。表明只進行手術過程而不穿線不會造成大鼠神經和運動功能缺失。神經功能評分和運動能力評分, 康復組優于模型組, 神經功能在手術后 3 周兩組比較差異有顯著性意義（P<0.05） ; 轉棒行走訓練和平衡木步行訓練,術后 3 周模型組與康復組比較有高度顯著性意義（P<0.01）,術后 5 周比較差異有顯著性意義 （P<0.05） ; 網屏實驗, 在手術后3周和5周比較差異有顯著性意義（P<0.05） , 見表 1。兩組大鼠在手術后5周進行學習記憶能力測評, 結果顯示康復組Y-型迷宮學習分辨能力明顯優于模型組, 其達到掌握標準所需次數明顯少于模型組, 兩組比較有高度顯著性意義（P<0.01） ,見表2。

2.2 NF200 染色結果及陽性產物顆粒圖像分析儀統計結果

2.2.1 免疫組化染色結果: 在光學顯微鏡下, NF200免疫組化染色顯示:假手術組大鼠大腦皮質 NF200陽性表達主要為一些不同走向的神經纖維,少見有神經細胞。陽性纖維著色深褐色, 排列規則, 縱橫交錯,分布密集, 粗細均勻, 紋理清晰, 呈條索狀走向。模型組和康復組在手術后 1 周均可見梗死灶*的NF200 陽性纖維顯著減少,排列紊亂,分布稀疏,粗細不均勻, 著色淺淡, 纖維變短, 多處出現串珠樣改變, 條索狀走向中斷, 兩組在梗死灶邊緣區可見散在的 NF200 陽性神經元。在手術后 3 周, 模型組梗死灶*區 NF200 陽性纖維開始增多, 排列紊亂, 康復組陽性纖維數量明顯增多, 纖維明顯增粗并扭曲,染色加深, 呈輻射狀, 由梗死灶周邊向梗死灶*延伸。在手術后5周, 模型組陽性纖維較前稍有增多,仍較紊亂, 康復組 NF200 陽性纖維排列整齊,染色均勻,分布密集, 紋理清晰（圖1—3,見后置彩色插頁 1）。

2.2.2 NF200 陽性產物圖像分析儀統計結果: 采用圖像分析儀, 對每張切片隨機取上下左右中 5 個視野, 測定 NF200 陽性產物信號的面積（即占當時視野面積的百分比）,測定其陽性產物平均 OD值, 并減去背景光密度值, 得到校正光密度值。 統計結果顯示: 模型組和康復組手術后 1 周 NF200 陽性纖維光密度值與假手術組比較有極顯著性意義 （P<0.01） ,在手術后 1 周模型組和康復組比較差異無顯著性意義（ P>0.05） , 在手術后 3 周模型組和康復組比較差異有顯著性意義（ P<0.05） , 術后 5 周比較有極顯著性意義（ P<0.01） , 見表 3。

3 討論

實驗中對腦梗死大鼠行為學評估分神經功能、運動能力和學習記憶三個方面。神經功能評估可以反映缺血性損傷的程度,而且與大腦皮質缺血性壞死神經元的數目密切相關[6]。本結果表明運動訓練能明顯改善腦梗死大鼠的神經功能、運動功能、學習記憶能力。發現運動訓練能促進中樞在結構和功能上的可塑性變化。運動使腦梗死大鼠早期（1—2周）在梗死灶周圍可見膠質細胞增生及周邊散在的小血管芽向壞死區生長并形成膠質瘢痕,后期（3—4周）邊緣有明顯的血管和成纖維細胞增生, 在梗死灶內有肉芽和血管支架形成。同時促使梗死區周邊大量的細胞增殖, 側支循環改善, 并激活梗死灶周圍和對側相應皮質神經元功能, 從而增加大腦的血液循環, 減少梗死面積, 改善了腦缺血, 促進腦組織再生、修復[7]。本實驗中康復組腦梗死大鼠在第 3 周出現了神經功能和運動的明顯改變, 而在5周時主要表現為運動功能的改變。 研究發現腦損傷數周或數月后, 康復訓練使一些運動能力逐漸恢復, 主要是使傳入神經不斷刺激,引起大腦產生功能重組[8]。有學者指出腦梗死致運動皮質損傷后, 康復訓練能使鄰近的非損傷區發生功能重組, 非損傷區在運動功能的恢復上發揮重要作用[9]。康復訓練也可促進大腦損傷區形成功能環路的重建, 從而改善運動功能[ 10]。有關運動訓練促進腦學習記憶神經功能恢復的機制尚未清楚。其機制可能是通過多種途徑的復合機制而發揮作用的。余茜等[ 11]研究發現運動訓練可明顯改善運動神經功能和學習記憶能力, 使健側海馬突觸界面曲率和突觸后致密物厚度增大以及穿孔性突觸的百分率增多, 突觸穿孔后致密物變為節段, 出現多個活性區, 使得不同受體簇的不同活性區傳遞功能大大加強, 進一步加強了突觸傳遞功能, 使其習得性長時程增強 （long-termpotentiation, LTP）形成速度明顯快于模型組。并指出運動康復促進腦梗死大鼠學習記憶能力的恢復可能是通過影響腦梗死鼠健側海馬CA3區N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA） 受體通道開放電導水平、開放時間和開放概率來實現的。康復訓練后健側海馬突觸體游離鈣離子濃度變化可影響信息處理過程, zui終表現在學習記憶能力行為上, 表明運動訓練改善腦缺血大鼠學習記憶與海馬神經元SCF（ Ca）密切相關。Tischmeyer 等[12]報道大鼠在完成Y-型迷宮視覺辨別任務后, 其海馬c- fos mRNA 升高。在清醒大鼠海馬齒狀回誘導LTP可導致c- fos基因表達增高。NF是神經元*的結構蛋白, 它特異性的分布于神經元的胞體及突起內, 在胞體內多交叉成網。NF 形成細胞骨架并起維持作用, 此外在軸漿運輸中,對微管起協調作用。它代表了神經元的功能和。研究也發現神經絲與多聚核糖體關系密切,參與蛋白質翻譯過程。在病理情況下（如損傷和缺血） , 神經絲發生降解[13], 因此其表達水平能很好地反映神經元的病理變化。Bidmon等 [14]研究發現磷酸化NF200 陽性纖維主要為神經元軸突, 指出在腦缺血早期, 腦梗死灶*的陽性纖維明顯減少, 提示神經元軸突 NF200 蛋白質發生降解。NF200 蛋白質水平變化與神經元的敏感性呈正相關, 其降解被認為是鈣敏感蛋白質作用的結果。研究發現 NF200 與鈣敏感蛋白質是缺血導致遲發性神經死亡連鎖反應中的重要環節。此外 NF200 與突觸的超微結構相關, 其變化也會影響到突觸傳遞可塑性變化。本實驗中采用磷酸化 NF200 蛋白質作為神經元軸突的標記物, 觀察運動訓練對腦缺血大鼠神經功能、運動能力、 學習記憶能力和NF200蛋白質表達變化的影響, 探討運動訓練對中樞的形態和功能的可塑性影響。實驗中發現在手術后1周,模型組和康復組的NF200陽性纖維較假手術組明顯減少, 比較差異有顯著性意義（P<0.01）,康復組和模型組相應的行為學測試（神經功能和運動能力）也較假手術組明顯減退, 差異有顯著性意義（P<0.01）。提示腦梗死大鼠出現神經功能和運動能力的減低可能與NF200在腦缺血的情況下發生降解有關。在手術后3周康復組NF200陽性纖維數量明顯增多, 纖維明顯增粗并扭曲, 染色加深, 呈輻射狀, 由梗死灶周邊向梗死灶*延伸。康復組 NF200 陽性纖維表達（OD 值）較模型組明顯增加, 其差異有顯著性意義（ P<0.05） , 相應的行為學檢測提示康復組神經功能和運動能力明顯優于模型組。在手術后 5 周, 模型組陽性纖維較前稍有增多, 仍較紊亂, 康復組NF200陽性纖維排列整齊, 染色均勻, 分布密集, 紋理清晰,康復組NF200陽性表達OD值與模型組比較差異有極顯著性意義（P<0.01） , 其運動能力和學習記憶能力明顯優于模型組。在手術后 3 周和 5 周康復組NF200 蛋白質表達增加提示運動訓練促進神經元軸突發芽和再生并有突觸形成。目前已證實神經元軸突的發芽和突觸形成與動物的行為學恢復密切相關。本實驗中 NF200 蛋白質表達增加的同時有腦梗死大鼠行為學的改善（包括了神經功能、 運動能力和學習記憶能力的改善）。以上結果表明運動訓練能明顯改善腦缺血大鼠神經功能、運動能力和學習記憶能力, 可能與運動訓練促進神經元軸突的再生和發芽機制有關。同時由于運動訓練能增加神經元軸突

發生出芽和形成新的突觸, 增加突觸曲率及PSD含量, 導致突觸結構的可塑性變化, 形成新的神經回路, 促進神經元信息網絡聯絡網的重建, 從而促進腦梗死大鼠運動和學習記憶能力康復。