“七分制樣,三分電鏡”,這是電鏡人常掛在嘴邊的一句話。電鏡后的結果好不好,很大程度上取決于樣品制備。樣品制備的后一步,就是染色。
染色,是為了提高樣品在電鏡下的反差。圖像的反差通常來源于樣品對電子束的散射能力,而它的散射能力則取決于原子組成。
原子序數越高,電子密度越高,散射電子能力越強,電鏡下顯黑色;
原子序數越低,電子密度越低,散射電子能力越弱,電鏡下顯白色。
生物樣品主要由 C、H、O、N、P、S 等低原子序數的元素組成,不足以形成足夠的反差。若利用重金屬離子對不同細胞結構的結合能力不同,使各細胞結構對電子產生不同散射程度,則可以增強樣品的反差。
常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛(pH 值在 11 左右)。
醋酸雙氧鈾:以提高核酸、蛋白質和結締組織纖維的反差為主。
檸檬酸鉛:對各種組織結構都有廣泛的親和作用,尤其是細胞膜系統及脂類物質,對不能被鋨酸染色的糖原更具有染色作用。
結合鈾和鉛不同的染色特性,目前超薄切片染色大多都是將兩種試劑結合互補,雙重染色。即先用醋酸鈾染色后,再用檸檬酸鉛,以獲得滿意的染色效果。
染色方法主要有兩種:
組織塊染色:在脫水至 70%乙醇或bin酮時,將組織塊放在用 70%乙醇或bin酮配制的飽和醋酸鈾溶液中,染色時間 2 小時以上,或在冰箱中過夜。切片后無需鈾染,直接檸檬酸鉛染色。
切片染色:對載網上的超薄切片進行染色,通常為雙染色,即*行醋酸鈾溶液染色,一般 10-30min,雙蒸水清洗后再進行檸檬酸鉛染色,一般 5-15min,鉛染后雙蒸水清洗。染色方法如下:
剪一片封口膜,鋪在桌面上,使用時揭開保護層,滴數滴染液于封口膜上,用鑷子夾住載網的邊緣,把貼有切片的一面朝下,使載網浮在液滴上,蓋上培養皿,染色 10-30min。染色時盡可能避光。載網從染液中取出后,必須盡快用雙蒸水清洗干凈。在染色過程中,鉛染液容易與空氣中的二氧化碳結合形成碳酸鉛顆粒,而污染切片。因此,在保存和使用染液時,要盡量減少與空氣的接觸。為防止鉛沉淀污染,可在培養皿內放置少許氫氧化na,以吸收空氣中的二氧化碳。
另一種方法是,使用商業化的染色硅膠板,多為圓形,用鑷子夾住載網邊緣,將其插在硅膠板縫隙中,在載網兩邊滴加染液,蓋上培養皿,清洗時,可直接用洗瓶沖洗多次即可。
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