移動端
直播推薦
回放
回放
資料類型
docx資料簡介
該試劑盒用于從克隆菌中大量提取去除內毒素的高品質質粒，一般來說可從200ml過夜培養的菌液中提取高拷貝質粒600-1200ug，低拷貝質粒50-400ug。試劑盒自帶的說明書為英文說明書，不是非常方便閱讀，所以本文根據英文原版重新翻譯了一遍，希望對大家有幫助。
實驗前準備
1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。
試劑盒型號 加入的乙醇量(ml)
D6926-00B 60
D6926-01B 160
D6926-03B 200
D6926-04B 200每瓶
細菌的培養：
1. 在容積為1-4升的培養瓶中加入200ml含篩選抗生素的LB培養基，加入含目的質粒的克隆菌(一般為1/1000比例接種，也即200ul)，然后置37℃振蕩培養12-16小時。為了獲得*的效果，*接菌使用經過夜培養活化的菌種。對于大多數質粒的提取，我們強烈*使用endA陰性的菌種，比如DH5α和JM109。
*的培養條件對于質粒DNA的得率至關重要。*的培養條件包括，首先由新轉化或新劃線的培養板中挑取單個克隆，然后接種于2-5ml含合適篩選抗生素的培養基中，37℃振蕩(搖床轉速設定在約300rpm為宜)培養約8小時；然后繼續接種于含抗生素的預熱的液體培養基中，37℃振蕩(~300rpm)培養12-16小時。盛培養基的容器的容積需至少為培養基體積的3-4倍(注：保證培養環境中有足夠的氧氣，防止厭氧菌的繁殖)，初始培養基接種的稀釋比例為1/500到1/1000為宜。
為了獲得*的效果，我們*每次培養后測定OD600值。對于過夜培養活化的細菌而言，OD600的值處于1.5-2.0之間是細菌生長良好的指標。在測定OD600時，為了保證測量值處于光度計測量的線性范圍(0.1-0.5)，需將培養物進行必要的稀釋(10到20倍)。當接種進行大量培養時，我們*細菌的終密度在2.0-3.0之間為宜。當使用富營養的培養基，需要注意保證細菌的密度不要超過OD600為3.0；如果使用凍存的甘油菌，需要首*行劃線并挑取單克隆，然后和前面一樣進行必要的活化。
富營養培養基如2xYT或TB，不*使用本試劑盒。
堿性-SDS溶液裂解細菌：
2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室溫離心10min收集菌體沉淀。
3. 小心去除上清液，為了保證所有上清去除*，可使用干凈的紙巾將容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體，重懸*對于獲得zui高的得率至關重要;
4. 加10ml SolutionⅡ，來回顛倒10-15次輕柔混勻，以得到澄清的裂解液。如有必要可室溫孵育2min。
避免混合時動作過于劇烈，過于劇烈會剪切細菌的染色體DNA(從而在接下來的步驟中不能被充分沉淀)并且導致質粒的純度降低。(當Solution II在不使用時，需要將瓶蓋旋緊，防止空氣中的CO2與Solution II反應生成碳酸鹽)
5. 加5ml Buffer N3，輕輕顛倒充分混勻幾次直至白色絮狀沉淀出現。室溫放置2—3min，期間偶爾顛倒混合，以使其充分反應。
注意：該溶液必須充分混合。如果混合物依然非常的粘滯，呈褐色并且成團狀，則需要進一步混合以充分中和該溶液，充分中和對于獲得更好的得率至關重要。使用冰預冷的Buffer N3將有利于沉淀更多的細菌蛋白。
6. 準備結合柱：加5ml的Buffer GPS至結合柱中，室溫放置3—10min，3,000—5,000×g室溫離心5min，棄濾液(注：這里中文說明書中添加了一步“往柱子里加入10ml無菌水離心棄濾液”，而在英文原版中是沒有的)，把柱子插回50ml收集管中。(注：這里可以使用一個舊的50ml離心管收集廢液，而將試劑盒中附帶的新離心管用于zui后一步質粒洗脫時使用)。
使用針筒式過濾器過濾裂解物：
7. 將第5步得到的裂解液及沉淀物全部轉移至針筒式過濾器中，準備一個干凈的50ml離心管收集濾液。將過濾器的活塞插回針筒。
8. 將針筒對準50ml收集管，輕輕推動活塞，收集澄清的濾液。一些裂解液中可能仍然殘留有絮狀沉淀物，不要強行將這些殘留的裂解液推擠過柱。
9. 加入等體積的ETR Binding Buffer(~25ml)到結合柱上，上下反復顛倒7-10次。
使用HiBind結合柱純化質粒DNA(注：離心法，適用于同時抽提多個樣品，對于樣本量較少時，*使用后面的真空抽濾法)
10. 小心轉移裂解液至HiBind結合柱，3,000—5,000×g離心3—5min,使液體濾過柱子，棄濾液。
11. 重復步驟10，直至所有裂解液都過濾完，棄濾液。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min,使全部液體濾過柱子，棄濾液。
13. 加入10ml Buffer EHB到結合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預先添加了乙醇)到結合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
注意：試劑盒附帶的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用無水乙醇稀釋。如果試劑是低溫保存的，使用前需要預先恢復溫度至室溫。
15. 加入10ml DNA Wash Buffer到結合柱上3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
16. 把空柱子套回離心管，zui大轉速(不超過6,000×g)離心10—15min使柱子充分干燥。不要跳過該步驟-該步對于去除柱子中殘留的乙醇非常關鍵。
使用HiBind結合柱純化質粒DNA(注：真空抽濾法，對于樣品個數較少時，該方法比較節省時間)
10. 安裝好抽濾裝置，將結合柱與抽濾瓶密閉結合
11. 轉移裂解液至HiBind結合柱，使液體全部濾過柱子。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結合柱上，洗滌一次(注：流速可能會比較慢)。
13. 加入10ml Buffer EHB到結合柱上，洗滌一次。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer(預先添加了乙醇)到結合柱上，洗滌一次。
15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗滌一次。
16. 繼續抽真空10-15min，以充分干燥結合柱(注：當抽提多個樣品時，可以選擇離心法步驟16中的方法以節約時間)。
由結合柱洗脫質粒DNA(常規方法，也可以使用后面介紹的另一種洗脫方法)
17. 進一步干燥柱子：選擇以下任一種方法在洗脫前進一步干燥結合柱
A. 將結合柱轉移真空抽濾裝置上室溫抽濾15min
B. 將結合柱放入65℃恒溫烤箱，烘烤10—15min
18. 把結合柱套在一個新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)，加入1—3ml(注：依據要求的質粒終濃度，可以分步兩次洗脫，第1次少量洗脫保證得到高濃度的質粒，第二次稍加大洗脫體積，保證盡可能將質粒洗脫*) Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結合柱的膜上，室溫放置2—5min，以zui高轉速離心(不超過6,000xg)5min洗脫質粒DNA。
上面描述的方法可以回收大約60-80%柱結合的DNA。也可以選擇進行二次洗脫從而將所有殘留的DNA全部回收，但二次洗脫的DNA濃度會低一些。另外，第二次洗脫也可以使用*洗脫下來的液體以保證得到較高濃度的質粒DNA。將洗脫液或去離子水預熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升zui終的得率。
注意：使用該方法得到的質?？梢院芎玫膽门cPCR，限制性酶切，脂質體轉染等。預期的質粒濃度可能依據質粒的拷貝數不同存在一些出入。但是，一般來說高拷貝的質粒終濃度在150-600ug/ml。該方法得到的質粒可能會包含一些乙醇殘留，但一般不會影響下游實驗。如果需要獲得更高的質粒濃度和*去除乙醇殘留，可以選擇使用下面的方法。
另一種結合柱洗脫質粒DNA的方法
1. 把結合柱套在一個新的50ml離心管中(注：可以使用試劑盒附帶的離心管)，加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer(或去離子水)至結合柱的膜上，室溫放置2min，以zui高轉速離心(不超過6,000xg)5min以洗脫質粒DNA。將洗脫液或去離子水預熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升zui終的得率。
2. 將洗脫的質粒DNA轉移到一個干凈的適用于沉淀的離心管中。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室溫放置的異丙醇。渦旋以充分混勻，然后以不低于15,000×g轉速4℃離心30min。小心地去除上清。
3. 用2ml 70%的乙醇洗滌沉淀一次，以不低于15,000×g轉速4℃離心10min，小心地去除上清。空氣干燥沉淀5-10min。
4. 加入200-500ul(依據要求的質粒終濃度)Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去離子水重懸DNA。
免責聲明
- 凡本網注明“來源：儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其他方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
浙公網安備 33010602002722號
2025廣州國際分析測試及實驗室設備展覽會暨技術研討會
展會城市：廣州市展會時間：2025-03-05